氣相色譜法 分析檢測小蝦中的吲哚

氣相色譜法
    
A 試劑
    
A.a 純化的水
    用Milli-Q水凈化系統處理的蒸餾水，或等效的。
A.b 溶劑
    無水乙醚〔含0.05%乙醇〕、乙酸乙酯、正已烷，用玻璃蒸餾器蒸餾。
A.c 碳酸鹽緩沖液
    約pH9.6，0.2M Na2CO3和0.2M NaHCO3。21.2g Na2CO3和16.8g NaHCO3溶于水并稀釋到1L。
A.d 硅膠
    干的70－230目硅膠60在125℃于敞開的容器中，層厚小于等于2cm，2h。每25g干燥過的硅膠加3g水，在旋轉振搖器上大于等于4h，于氣密性容器中保存。
A.e 吲哚標準溶液
    
A.e.1 貯備液Ⅰ
    1.00mg/ml。100mg吲哚溶解在100ml容量瓶中的乙醇中，用乙醇稀釋至刻度。
A.e.2 吲哚標準溶液Ⅱ
    20μg/ml，吸取2ml貯備液于100ml容量瓶內，用乙酸乙酯稀釋至刻度。
A.e.3 吲哚標準溶液Ⅲ
    5μg/ml。吸取25ml標準溶液Ⅱ于100ml容量瓶中，用乙酸乙酯稀釋至刻度。
A.e.4 吲哚標準溶液Ⅳ
    2μg/ml，吸取10ml標準溶液Ⅱ于100ml容量瓶中，用乙酸乙酯稀釋至刻度。
A.e.5 吲哚標準溶液Ⅴ
    1μg/ml，吸取5ml標準溶液Ⅱ于100ml容量瓶中，用乙酸乙酯稀釋至刻度。
A.f 2-甲基吲哚溶液
    
A.f.1 貯備液Ⅰ
    1mg/ml。溶解100mg 2-甲基吲哚于100ml容量瓶中的乙醇內，用乙醇稀釋至刻度。
A.f.2 稀貯備液Ⅱ
    50μg/ml，吸取5ml貯備液于100ml容量瓶內，用乙醇稀釋至刻度。
A.f.3 工作標準溶液Ⅲ
    10μg/ml，吸取20ml貯備液Ⅱ于100ml容量瓶內，用乙醇稀釋至刻度。
B 儀器
    
B.a 氣相色譜儀
    帶有N-專用檢測器。6ft×2mm〔內徑〕玻璃柱，填裝已二酸新戊烷基乙二醇酯〔NPGA〕或等效的。調節基線電流、空氣流速和氫氣流速，使5μg吲哚的響應值大于記錄儀50%滿刻度的讀數值〔3μl校準溶液4，表17-1〕，調整色譜條件，使吲哚和2-甲基吲哚的保留時間分別為6.8和9.4min左右。基線變化可得到3-正丁基磷酸酯〔約5min〕、吲哚、3-甲基吲哚〔約8min〕和2-甲基吲哚的色譜峰。
B.b 色譜柱
    下面〔1〕或〔2〕。
B.b.1 NPGA
    在400ml燒杯里，用100ml氯仿溶解1.2g NPGA，攪動溶液加入10.8g、80－100目酸洗過的擔體，置于汽浴上，攪動，以蒸發溶劑。轉移擔體到旋轉蒸發器中，以40－50℃、真空去除最后的溶劑。用5%的二甲基二氯硅烷的甲苯溶液充滿清潔的干玻璃柱，(a)，靜置5min〔注意：二甲基二氯硅烷有毒，避免接觸皮膚或眼睛，開啟有效的排風裝置〕。用約50ml甲醇洗柱，氮氣下干燥。用涂漬好的載體裝柱，并于室溫下，N2氣流吹洗大于等于2h，以10ml/min、N2 220℃，老化24h。$$典型條件是：溫度〔℃〕－柱，195；汽化室，220；鑒定器，250；載氣流速約30ml N2/min。
B.b.2 SuperPak20M
    用5%二甲基二氯硅烷的甲苯溶液，裝入清潔的干燥玻璃柱中，靜置5min，用約50ml甲醇沖洗，并于N2下干燥。用Super Pak 20M填裝柱子，于室溫下，用He氣流吹洗大于等于3h。以He20ml/min、220℃老化24h。$$典型氣相操作條件是：溫度〔℃〕－柱，160；進樣口，220；檢測器，250；載氣流速30ml He/min。
B.c WhatmanIPS相分離濾紙。
    
C 校準
    制備校準溶液的體積數如表17-1所示：$$ $T 表17-1 氣相色譜測定小蝦中吲哚的校準溶液$$校準溶液@吲哚標準溶液@吲哚濃度μg/ml@ml@μg@2-甲基吲哚^a^ml@乙醇ml@總量ml$$1@Ⅴ@1@1@1@1@1@3$$2@Ⅴ@1@2@2@1@0@3$$3@Ⅳ@2@2@4@1@0@3$$4@Ⅲ@5@1@5@1@1@3$$5@Ⅲ@5@2@10@1@0@3$$6@Ⅱ@20@1@20@ 1@1@3$$a.2-甲基吲哚工作標準溶液，10μg/ml。$T吸取規定的體積，分別于帶有聚四氟乙烯襯里螺旋蓋的小瓶并混勻，冰箱內貯存。$$每種溶液平行進樣〔約3μl〕，測量峰高并計算峰高比，R＝吲哚峰高/內標峰高，以R對標準溶液中的吲哚微克數作圖，制備標準曲線。
D 測定
    稱取25.0g混勻的樣品于搗碎機缽內，加100ml碳酸鹽緩沖液，高速搗碎2min，定量轉移糊狀物于500ml分液漏斗中。用洗瓶中25ml水沖洗搗碎器缽，洗液加入分液漏斗內。加200.00ml乙酸乙酯于分液漏斗并劇烈振搖2min。$$使之分層，排下層入燒杯，如乙酸乙酯〔上層〕<150ml，離心下層，分離，合并所得的有機層。使有機層通過Whatman相分離紙，準確量取150ml濾液于玻塞燒瓶中，加1.00ml 2-甲基吲哚工作溶液和10g無水硫酸鈉，振搖1min。$$傾出萃取液，在約35－40℃水浴上，用旋轉蒸發器濃縮至5－10ml，不要蒸干〔另外，也可在50℃水浴上，氮氣流下濃縮〕。轉移萃取液到小玻璃瓶中，在氮氣流下濃縮至約1－1.5ml，加2ml正已烷并混合，加1.5g無水Na2SO4，劇烈振搖2min。$$制備凈化的柱，將玻璃棉緊塞10cm×15mm或10.5mm內徑的玻璃色譜柱底部，加6g硅膠并輕輕敲擊管以填實，在硅膠層頂部加約0.5cm厚的無水Na2SO4，吸取約2ml正已烷加在柱頂。正已烷被吸收后，立即轉移濃縮的萃取物〔含添加的正已烷〕入柱內，使柱層被沖擊的可能減至最小。當液體水平面到達Na2SO4頂部時，加10ml正已烷。同樣地，加10ml乙醚-正已烷(15+85)和40ml乙醚-正已烷(15+85)。收集全部柱洗脫液，50℃，N2下濃縮至約1.5ml，不要蒸干。$$做平行進樣，測量峰高并計算R值，從校準圖形上測定樣品I〔μg吲哚〕，計算每個樣品中的吲哚量。$$ μg吲哚/100g樣品＝I×100/[g樣品×(150/200)]$$從平行進樣的值，計算吲哚的平均量。