L-鄰氯扁桃酸的應用
背景及概述[1]
鄰氯扁桃酸，又名α-羥基鄰氯苯乙酸（2-chloromandelicacid），分子式C8H7O3Cl，相對分子質量為186.5，具有R型和S型兩種對映體構型，在醫藥生產、不對稱合成、光學拆分等多個領域都有廣泛的應用。而其中L-鄰氯扁桃酸可以合成新型安全高效的抗血小板聚集藥物氯吡格雷（clopidogrel）。氯吡格雷的化學名為(+)-(S)-α-(2-氯苯基)-6,7-二氫噻吩并[3,2-c]吡啶-5（4H）-乙酸甲酯，臨床上用于預防心肌梗塞、中風或有外周動脈疾病史患者的動脈粥狀樣硬化，與其它幾種應用比較廣泛的血小板抑制劑（阿司匹林、噻氯匹定等）相比較，作用強度和耐受性高于噻氯匹定，而與阿司匹林的總體耐受性相似，副作用也較其它幾種血小板抑制劑更小。該產品由法國賽諾菲和美國施貴寶于1996年聯合開發，1997年獲得FDA批準，1998年3月正式在美國上市，商品名為“波立維”，2008年全球銷售額為94億美元，單藥銷售收入排名全球第二，是目前最暢銷的藥物。
應用[1]
L-鄰氯扁桃酸可以合成新型安全高效的抗血小板聚集藥物氯吡格雷：
制備[1-2]
1. 不對稱合成法
不對稱合成法是不經過拆分直接合成手性產物的一種方法，主要有：手性醇氰酶-化學法、腈水解酶法、不對稱還原法、化學合成法等。目前，以手性催化劑不對稱合成的方法很少在生產中得到應用，這可能是因為化學催化劑及其合成所需化學試劑價格昂貴，而生物催化劑催化效率仍然不高等問題，而鄰氯扁桃酸的空間位阻也是限制其催化效率的主要因素。但近年來對不對稱合成法的研究呈上升趨勢，許多方法都得到高選擇性的產物。
1）手性醇氰酶-化學法
手性醇氰酶（hydroxynitrileslyases，HNL，E.C.4.1.2.10）是一種來源于高等植物、用來抵御外敵的關鍵酶，能高度選擇性地催化合成手性氰醇。手性醇氰酶法從醛或酮出發，加入氰氫酸，合成具有光學活性的α-羥基酸為終產物的方法，可用于合成L-鄰氯扁桃酸。
以往氯取代的苯甲醛及其衍生物由于空間位阻的限制而無法提高產量及選擇性，近來隨著微水相有機相（二異丙醚）、緩慢添加底物方法、固定化技術等的結合，提高了腈產物的立體選擇性。
2）腈水解酶法
腈水解酶法是直接催化腈水解、一步生成羧酸及氨的方法，腈水解具有高度化學、區域和立體選擇性。目前關于立體選擇性腈水解酶的報道很多，但是能作用于芳基乙腈類的不多，已有研究表明，糞產堿菌、惡臭假單胞菌等能夠產生立體選擇性的腈水解酶，作用于外消旋扁桃腈，水解生成(R)-扁桃酸，并且產物的e.e.值都較高。但是以扁桃腈苯環上鄰位取代的衍生物作為底物的研究報道則很少。DeSantis等通過直接提取環境中的DNA，創建了基因文庫，對該基因文庫進行篩選，得到200多種腈水解酶。將這些腈水解酶用于混旋扁桃腈的水解，發現其中27種具有水解活力，對其中活力最高的腈水解酶Ⅰ進行底物特異性研究，發現可作用于鄰氯扁桃腈，得到L-鄰氯扁桃酸，e.e.為97%，但是酶活力不高，機理見圖。
3）對稱還原法
利用手性的還原酶的催化作用，也可以得到單一的對映體。從Leuconostoc mesenteroidessubsp.dextranicum菌株中分離得到α-酮酸還原酶，在NADH輔酶條件下，能生產手性的α-羥基酸。將該還原酶分離純化后催化還原2-氯苯乙酮酸得到L-鄰氯扁桃酸，其產率達100%，e.e.值大于99%。而利用E.coli重組細胞表達這種還原酶，同樣成功達到高產率高選擇性生產L-鄰氯扁桃酸的目的。但合成2-氯苯乙酮酸底物的步驟復雜繁多，輔酶價格昂貴，增加了生產的成本。直接利用面包酵母還原制備L-鄰氯扁桃酸及其酯化合物，以2-氯苯甲酰甲烷、2-氯苯甲酰乙烷、2-氯苯甲酰丁烷為底物轉化為2-氯扁桃酸烷酯，轉化率分別為99.9%、88.5%、99.7%，手性e.e.值分別為98.4%、98.5%、98.4%，進一步水解得到酸產物。酵母還原的方法簡便，過程精簡，成本低廉，但缺點是步驟繁多。
4）化學合成法
化學合成法是利用化學的方法不對稱合成手性產物，較生物法合成效率高穩定性好。用氰化和乙酰化方法從2-氯苯甲醛出發利用手性配體，手性催化法制備(R)-o-乙酰氰醇，然后通過水解(R)-o-乙酰氰醇獲得L-鄰氯扁桃酸，但這個步驟需要重結晶，并存在許多反應過程中的問題。采用將鄰氯苯乙醛立體選擇性的制得對應的氰化的腈，再水解得到鄰氯扁桃酸。具體方法是2-氯苯乙醛與三乙基硅氰制得(R)-鄰氯扁桃腈硅酯，然后水解得到L-鄰氯扁桃酸并重結晶純化，得到大于99%的純度。而此類化學合成法需要催化劑價格昂貴，反應污染大，回收不便，反應條件要求嚴格。
2. 光學異構體拆分法
光學異構體拆分是首先建立在合成外消旋的、鄰氯扁桃酸、然后再拆分的方法。光學拆分是目前主要用于制備手性鄰氯扁桃酸的方法，雖然仍然受到空間位阻的影響，但許多拆分劑都能達到較好的拆分效果，國內目前研究較多，在拆分機理方面也進行了相關的研究。
1）外消旋鄰氯扁桃酸合成
目前合成外消旋鄰氯扁桃酸的方法主要以下幾種。①相轉移催化法。采用四乙基氯化銨（TEAC）和四乙基溴化銨（TEAB）等作為相轉移催化劑，產物經乙酸乙提取以及苯或甲苯重結晶后，粗產率可達95%，純品產率可達54%，產品純度可達99%，且反應時間縮短為24h。用便宜易得的氯仿來代替溴仿來改進上述方法，大大降低了生產成本，且整個制備過程中不需要取出鄰氯扁桃酸的粗品，操作輕松，產品質量高，適合工業應用。②氰化水解法。通過氰化、水解、除鹽和精制4步操作得到鄰氯扁桃酸，收率約為70%。與之前不同的是，該法采用的氫氰酸為氣體氰化氫或質量分數為20%～80%的氫氰酸水溶液，原料易得，并且提高了收率。③酶催化法。報道利用RhodococcuserythropolisNCIMB11540全細胞中的腈水合酶和酰胺酶的共同作用，將鄰氯扁桃腈水解成鄰氯扁桃酸。④以鄰氯苯甲酸或鄰氯苯乙酮為原料合成法。以鄰氯苯甲酸為原料，在三乙胺的作用下與二倍量的二乙偶磷氰酸酯（DEPC）反應，得到二氰基磷酸鹽，然后在酸性條件下水解，得到鄰氯扁桃酸，收率為89%。以鄰氯苯甲酸或鄰氯苯甲醛為起始原料，制備鄰氯苯甲酚氯，鄰氯苯甲酞氯和丙二酸二乙酯在乙氧基鎂的催化下反應，在酸性條件下脫羧得到鄰氯苯乙酮，然后對鄰氯苯乙酮進行氯化、水解，獲得最終產品鄰氯扁桃酸，純品收率為84.7%。
2）外消旋鄰氯扁桃酸拆分
A：非對映體鹽法拆分，化學拆分外消旋體是一種傳統方法，它是用手性試劑將外消旋體混合物中的兩個對映體轉變成非對映體，然后利用其物理性質差別將非對映體分開（如用重結晶法），最后脫去拆分劑，就可分別得到一種對映異構體。通過形成非對映體鹽法來拆分化學合成的外消旋鄰氯扁桃酸，從而得到兩種對映體。該法十分成熟，易于實現工業化，利用光學活性的α-苯乙胺（PEA）拆分扁桃酸已成熟。而對于鄰氯扁桃酸，N-芐基-α-苯乙胺（BPA）首先被用做拆分劑，在乙酸異丙酯中進行拆分，所得產品的光學純度可達99%以上，收率大于90%。但BPA價格昂貴，不宜大規模工業化制備，而且該方法需要重結晶。采用光學活性的1-(p-硝基苯基)-2-氨基-1,3-丙二醇（SA）作拆分劑，添加適量的NaOH，以水作溶劑，所得產品光學純度99%，拆分劑回收方便，其回收率在90%以上。拆分實驗的基礎上，運用三點作用模型，結合HMR分析，探討了氫鍵、空間位阻等在拆分過程中的作用，研究表明拆分劑通過形成非對映體鹽法拆分外消旋體的過程中，成鹽鍵力是拆分的基礎，非對映體鹽間氫鍵的存在對拆分起關鍵作用，空間位阻等多點性作用力對拆分結果有一定的影響。也有使用其它拆分試劑，如光學活性丙氨酸來拆分得到手性純的鄰氯扁桃酸。通過(S)-(+)-丙氨酸或(R)-(-)-丙氨酸與外消旋的鄰氯扁桃酸混合溶解，然后重結晶，在兩相溶液中分離混合物，最后在有機溶劑中提取鄰氯扁桃酸，得到高手性純的產物。
B：酶法拆分：酶法拆分是一種動力學拆分方法，最常用的就是通過降解其中一種對映體，而留下另一種構型，達到拆分的目的。篩選到一株含立體選擇性扁桃酸脫氫酶的產堿菌，該菌通過選擇性降解鄰氯扁桃酸中的S型對映體，進而得到R型鄰氯扁桃酸，收率可達46%，e.e.達99.9%，但是若增大底物濃度至50mmol/L，e.e.值則會大大降低。由于該法采用選擇性降解其中一種構型得到所需的對映體，因此轉化率受到限制，無法超越50%，具有一定的局限性。
C：清池譜法拆分：以氨基酸和金屬離子作為手性流動相添加劑的配體交換色譜已經被廣泛應用于手性物質分離，但是用于拆分手性扁桃酸及其衍生物則較難，因其紫外吸收波長短，而最常用的Cu2+作為配合離子時有很強的紫外吸收。分別考察了3種L-氨基酸（脯氨酸、苯丙氨酸和亮氨酸）和5種金屬離子（Cu2+、Zn2+、Fe2+、Fe3+和Cd2+）不同組合對鄰氯扁桃酸的拆分。結果表明，以Zn2+作配合離子與亮氨酸組合，可以較好地拆分鄰氯扁桃酸。而利用手性柱也能達到拆分鄰氯扁桃酸的目的，有報道稱改變不同的流動相配比，選用Chiralcel等各種高效液相色譜柱柱型，均可較好地拆分鄰氯扁桃酸。色譜法具有較好的容量、選擇性和穩定性，拆分純度最高，在手性拆分中發揮越來越重要的作用，但是該法設備費用太高，消耗大，成本太高，處理量小，因此僅限于檢測以及實驗室制備無法用于商業生產。
D：分子印跡法拆分：目前也有報道采用分子印跡技術來拆分鄰氯扁桃酸。采用分子印跡技術合成仿生高分子材料，即分子印跡聚合物（MIP，類似于大孔吸附樹脂的高分子吸附材料），應用于手性分子識別的研究，正逐漸受到人們的重視。分子印跡聚合物是由模板分子（待測或待分離分子）、可聚合的功能單體、交聯劑和引發劑聚合成固狀材料后，洗脫除去模板分子而得，聚合物中模板分留下的孔穴及孔穴上活性基團與模板分子的形狀及官能團互補，對難以分離的手性異構體可進行較好地檢測和分離。以右旋鄰氯扁桃酸為模板，丙烯酰胺、乙二醇二甲基丙烯酸酯分別為功能單體和交聯劑，采用沉淀聚合法制備了分子印跡聚合物微球，省卻傳統聚合法中粉碎、研磨等步驟，具有比傳統分子印跡聚合物更高的結合量和更快的結合速率。并且通過紫外研究了模板與單體之間的作用力，利用Hyperchem模擬了兩者形成的配合物的分子結構，在MIP中留下的兩種結合位點由Scatchard分析得到證實。由于有特異識別性的結合位點，MIP對右旋鄰氯扁桃酸具有較高的識別能力，MIP顆粒有望作為高效液相色譜柱材料用于拆分鄰氯扁桃酸外消旋混合物。該小組還以混旋鄰氯扁桃酸為模板分子和合成的(S)-(1-萘乙基)-丙烯酰胺為手性功能單體制備MIP作為色譜固定相，對混旋鄰氯扁桃酸有較好的拆分能力，分離因子達到1.36，從而打破了必須以純光學對映異構體為模板的局限性，使分子印跡技術得到進一步應用。
E：毛細管電泳法拆分：毛細管電泳（CE）是一種電遷移技術，因具有高效、快速、經濟等特點，廣泛應用于各種藥物對映體的分離，其原理是加入手性選擇劑使與對映體分別結合，根據對映體和選擇劑結合的穩定常數的區別進行分離。該方法使用的手性選擇劑主要是環糊精β-CD或改性β-CD，其機理是基于環糊精疏水空腔與對映體的包含作用的差異。考資料
[1] L-鄰氯扁桃酸的制備技術進展
[2] 鄭裕國，薛亞平，柳志強，等. 生物催化法生產R-扁桃酸及其衍生物的方法：中國，101701243[P]. 2010-05-05.