pH及離子強度對抗癌藥物白藜蘆醇與人血清白蛋白相互作用的影響

     白藜蘆醇(Resveratrol，Res)，化學名為3，4’，5一三羥基二苯乙烯，是植物在遇到紫外線照射、真菌感染等不利條件下自然產生的抗毒素，目前至少已在21個科、31個屬的72種植物中發現，其中在葡萄、虎杖和花生中含量較高[1]．白藜蘆醇有很多生物學功能，如調節脂蛋白代謝，抑制低密度脂蛋白氧化l2一 ，抑制血小板聚集和減少前列腺素的產生l3]，清除過氧亞硝基陰離子引起的DNA損傷 ．Jang研究小組于1997年首先報道白藜蘆醇具有較強的抗腫瘤活性，對腫瘤產生的3個階段都有抑制作用l5]．此后許多研究證實白藜蘆醇對皮膚癌、乳腺癌、肺癌、胃癌等多種腫瘤細胞有抑制作用[6]，目前世界上有1o余個國家和地區在開發白藜蘆醇原料及制劑，白藜蘆醇被喻為繼紫杉醇之后的又一新的綠色抗癌藥物，被人們廣泛關注．

盡管白藜蘆醇的藥物活性得到了廣泛的承認，但有關其在體內的運輸及分布所知甚少．白藜蘆醇的水溶性很低，在血液中必須與蛋白結合以保持較高濃度．本課題組報道了白藜蘆醇通過與人血清白蛋白(Human serum albumin，HSA)和血紅蛋白(Hemoglobin)結合完成體內運輸l7 ．HSA是在人體血漿中含量最豐富的蛋白質，可廣泛結合內源和外源性物質，如脂肪酸、代謝物、藥物和金屬離子，起著儲存和運輸的作用．藥物和HSA的相互作用會影響藥物在體內的運輸和分布，對其相互作用的研究對于確定藥物的作用機制、藥物代謝動力學等方面具有積極意義．本課題組在研究白藜蘆醇與HSA相互作用中，發現疏水作用是兩者結合的主要作用力 ]．在兩者的結合中，是否也存在靜電作用還少見報道．本文中運用熒光光譜法測定不同pH及離子強度下，白藜蘆醇與HSA的結合常數，應用分子對接方法計算了白藜蘆醇在HSA上的具體結合位點，分析了靜電作用在兩者結合中的作用．該實驗結果為研究白藜蘆醇在體內的轉動機制提供一定的依據．

1 實驗部分

1．1 試劑與儀器白藜蘆醇(99~／／0)和HSA(99％)均購自美國Sigma公司，其它化學試劑均為分析純，實驗用水為Milli—Q超純水．Cary一100紫外一可見光譜儀(澳大利亞Varian公司)，F一4500熒光光譜儀(日本Hitachi公司)，pHS-29A酸度計．

1．2 溶液配置白藜蘆醇溶于50 DMSO中作為母液，4℃ 暗處保存，臨用前用PBS(pH 7．4)稀釋至 2．0×10 mol L 備用；HSA在使用前用緩沖液配成2．0X 10 mol L 溶液備用，其摩爾濃度由分子量66 500 Da計算得到．

1．3 熒光測定白藜蘆醇對HSA的熒光猝滅以280 nm作為激發波長，狹縫寬度為5 nm／5 nm，掃描速率為240 nm min ，記錄290 nm至410 nm熒光光譜．測定過程如下：準確移取3 mL濃度為2．0×10 tool L 的HSA溶液于1 cm石英比色皿中，用微量注射器逐次加入2．0×10 mol I 的白藜蘆醇溶液進行熒光滴定，總滴定量不超過蛋白體積的3．5 ．蛋白與藥物充分混合保持10 min后測量．

1．4 pH對HSA-白藜蘆醇相互作用影響 用0．15 mol I NaC1水溶液分別配制0．2 mol L pH 5．0 HAc-NaAc緩沖液，0．2 tool L～ pH 6．0、pH 7．0 Na2HP04一NaH2PO4緩沖液，0．2 mol L— pH 8．0 Tris-HCl緩沖液．維持體系pH值和離子強度不變，分別用上述緩沖液配制HSA貯液．按上述測定熒光光譜方法，測定不同pH下的HSA與白藜蘆醇相互作用熒光光譜．

1．5 離子強度對ItSA-白藜蘆醇相互作用影響在PBS中分別加入不同濃度的KCl(O、0．05、0．1、0．2 mol I )，按上述測定熒光光譜方法，測定不同離子強度下HSA與白藜蘆醇相互作用熒光光譜．

1．6 分子對接采用AutoDock 3．05程序包計算【9]．HSA和白藜蘆醇的晶體結構來自蛋白數據庫(HSA 編碼：lh9z，白藜蘆醇編碼：ldvs)．化合物的幾何結構采用AutoDockTools軟件優化l_1 ．相互作用采用 Lamarckian遺傳算法，配體采用柔性處理方式，分子對接起始位置、方向隨機，每個計算包括100個循環．遵循能量及幾何匹配原則來選擇最優結果．

2 結果與討論

2．1 白藜蘆醇對IISA的熒光猝滅在生理pH(7．4)下，不同濃度的白藜蘆醇與HSA作用后蛋白的熒光光譜變化見圖1．由圖可知，在激發波長為280 nm條件下，HSA在337 nm處有最大發射峰．白藜蘆醇的加入導致 HSA的內源熒光發生猝滅，存在濃度依賴關系，但最大發射峰的位置不變，說明白藜蘆醇與HSA之間存在相互作用．

2．2 pH對HSA-白藜蘆醇熒光光譜的影響在280 nm激發波長下，HSA-白藜蘆醇在不同pH 緩沖液中的熒光光譜見圖2．由圖知，不同pH值沒有引起HSA-白藜蘆醇的熒光最大發射峰發生移動，但熒光強度發生變化，且隨pH增大，熒光強度增強．

2．3 不同pH下HSA-白藜蘆醇結合參數熒光猝滅數據可由Stern-Volmer方程進行分析 ：下 F0 一I+KsVEQ] (1)

FO和F分別是無猝滅劑和存在不同濃度猝滅劑時熒光物質的熒光強度，Ksv是Stern-Volmer猝滅常數，[Q]是猝滅劑的濃度．將Fo／F對白藜蘆醇濃度作圖(見圖3)，得到不同pH值下的Stern-Volmer猝滅常數．

由表中數據可知，不同pH值下白藜蘆醇對HSA的猝滅速率常數在10¨L tool。S。數量級．各種猝滅劑對生物大分子的最大動態猝滅速率常數為2×10 I tool。S_u“]，顯然表中的猝滅速率常數遠大于動態猝滅速率常數，說明不同pH值下白藜蘆醇對HSA的猝滅都是形成了復合物的靜態猝滅．同時還可看出，隨著pH的增加K 、，，K。和K都呈現增加的趨勢，即偏高pH值促進了白藜蘆醇與HSA的結合．白藜蘆醇為多酚類物質，在偏酸性條件下較穩定，隨著pH增加，離子化程度增加，由此可推測，在白藜蘆醇和HSA的相互作用中靜電作用力起到了一定作用．

2．4 離子強度對白藜蘆醇-HSA結合的影響在PBS中加入不同濃度的KCI，以研究離子強度對HSA與 白藜蘆醇結合的影響，結果見表3．當離子強度不斷增加時，HSA的最大發射峰位置未發生變化(圖未顯示)，表明離子強度不改變HSA-白藜蘆醇復合物的結構．由表可知復合物的結合常數隨離子強度的不斷增大而減小，表明離子強度影響HSA與白藜蘆醇間的親合力，離子強度越大，親合力越小．靜電作用在HSA與 白藜蘆醇的結合中起到了一定作用，這與pH影響研究結果相一致．

2．5 白藜蘆醇與HSA 相互作用的分子對接 白藜蘆醇與 HSA分子對接的最優能量結果見圖4．由圖可知，

白藜蘆醇位于HSA 上亞結構域工B和ⅡA 之間的疏水腔內，位點工的人口處．在距離白藜蘆醇 4×10。。1Tt范圍內，3個帶正電荷的氨基酸，Lysl06、Lys199和 His242，可與白藜蘆醇形成靜電作用，因而靜電作用在 白藜蘆醇與HSA的結合中發揮作用．這與前面pH及離子強度影響研究結果相一致．

3 結論

抗癌藥物白藜蘆醇由于其低的水溶性，在體內的運輸過程中必須與蛋白結合以保持其較高濃度．HSA 是人體外源及內源物質運輸的主要載體．本研究小組前期研究發現疏水作用是白藜蘆醇與HSA之間結合的主要作用力 ．本研究表明pH及離子強度均影響白藜蘆醇與HSA之間的相互作用，較高的pH及較低的離子強度有利于兩者結合．pH及離子強度實驗結果和分子對接結果均表明靜電作用在兩者結合中起到一定作用．本研究結果為了解白藜蘆醇在體內的轉動機制提供了一定的基礎．