HPLC法測定低分子量肝素鈉的分子量及其分布

提要　采用液相色譜法對低分子量肝素鈉(LMWH)分子量及其分布進行了測定。流動相選用2.84%的硫酸鈉溶液，采用紫外檢測器與示差折光檢測器串聯連接，紫外檢測波長234 nm，色譜柱為Protein-Pak Φ8 mm×300 mm。結果表明：所測三批LMWH的重均分子量分別為3 158 D,4 387D,4 226D；其中分子量小于8 000D的量分別為86.2%，89.4%，87.8%，符合英國藥典1993年增補版標準。

低分子量肝素鈉是商品肝素鈉經化學解聚而得的硫酸氨基葡聚糖的鈉鹽，臨床上主要用于術后深靜脈血栓、不穩定性心絞痛及血液透析等。近年來，國內外對低分子量肝素的劑型及臨床應用報道較多，但以HPLC法測定其分子量報道較少，現采用HPLC法對LMWH分子量及其分布進行測定。

1　實驗部分
1.1　儀器、藥品及試劑
高效液相色譜儀(Waters公司)。低分子量肝素標準品(HO190 000，進口，Mna為3 700)；供試品三批(色譜自制)；所用試劑均為色譜純。

1.2　方法［1］與結果
以Protein-Pak Φ8 mm×300mm為色譜柱，選用2.84%(w/v)硫酸鈉作流動相，柱溫40℃，示差折光檢測器進口與UV檢測器出口相連，紫外檢測波長為234nm。

精密稱取低分子量肝素標準品及供試品，按10 mg/ml的比例加流動相溶解；用流動相配制0.01mol/L的NaN3溶液。按以上條件進樣，進樣量10μl，用NaN3測得紫外檢測器與示差折光檢測器出峰時間有一定的間隔，其間隔時間為15 s．

根據標準品在RI曲線及UV234曲線下的面積計算r,r=ΣRI/ΣUV234［2］；圖譜上任一點的分子量Mi=Mna RIi/rUV234i(Mna為低分子量肝素標準品的數均分子量3700，RIi為此點的RI面積，UV234i為此點的UV234面積)，則供試品的重均分子量Mw＝Σ(RIiMi)/ΣRIi。分子量分布按RI色譜圖下小于8 000D的RI面積占RI總面積的百分數，結果見表1。

Table 1　The molecular weight and its distribution results ofLMWH

Batch NO. mw Molecular wieght distribution
9707 3158D 86.2%
9702 4387D 89.4%
9703 4226D 87.8%

2　討論
低分子量肝素的生物活性與其分子量及分子量分布密切相關，隨著分子量的降低，其抗FⅡa活性下降，因此低分子量肝素的分子量及分布是產品質量控制的關鍵指標。以往曾采用粘度法測定LMWH的分子量［3］，但此法不能考察其分子量的分布情況，實驗采用HPLC方法，快速準確地測定了LMWH的分子量及其分布。

由于示差折光檢測器與紫外檢測器串聯連接，因此由其產生的色譜圖之間有時間間隔，通過NaN3可準確測定二者的時間差，使所測數值更準確。另外，通過RI圖譜發現，鹽峰、溶劑峰與主峰保留時間較接近，如何使其影響更小是今后有待解決的問題。