核酸的定量測定:衣酚（苔黑酚）法

一、目的：了解并掌握地衣酚法測定RNA含量的基本原理和具體方法。

二、原理：RNA含量測定，除可用紫外吸收法及定磷法外，常用地衣酚法測定。其反應原理是：當RNA與濃鹽酸共熱時，即發生降解，形成的核糖繼而轉變成糠醛，后者與3，5-二羥基甲苯(地衣酚orcinol)反應，在Fe3+或Cu2+催化下，生成鮮綠色復合物。反應產物在670nm處有最大吸收。RNA濃度在20―250μg・ml-1范圍內，光吸收與RNA濃度成正比。地衣酚法特異性差，凡戊糖均有此反應，DNA和其他雜質也能與地衣酚反應產生類似顏色。因此，測定PNA時可先測得DNA含量再計算RNA含量。

三、器材與試劑：

1．器材：
①分析天平。
②沸水浴鍋。
③試管。
④吸量管。
⑤分光光度計。

2．試劑
①RNA標準溶液(須經定磷確定其純度)：取酵母RNA配成100微克/毫升的溶液。
②樣品待測液：配成每毫升溶液含RNA干燥制品50―100微克。
③地衣酚試劑：先配0.1%三氯化鐵的濃鹽酸(分析純)溶液，實驗前用此溶液作為溶劑配成0.1%地衣酚溶液。

四、操作步驟：
1．標準曲線的制作　取12支干凈烘干試管，按下表編號及加入試劑。平等作兩份。加畢置沸水浴加熱25min，取出冷卻，以零號管作對照，于670nm波長處測定光吸收值。取兩管平均值，以RNA濃度為橫坐標，光吸收為縱坐標作圖，繪制標準曲線。
2．樣品的測定　取兩支試管，各加入2.0ml樣品液，再加2.0ml地衣酚-Cu2+試劑。如前述進行測定。

五、結果與討論：
1．繪制出標準曲線
2．RNA含量的計算　根據測得的光吸收值，從標準曲線上查出相當該光吸收的RNA含量，按下式計算出制品中RNA的百分含量：

注意事項
(1)樣品中蛋白質含量較高時，應先用5%三氯乙酸溶液沉淀蛋白質后再測定。
(2)本法特異性較差，凡屬戊糖均有反應。微量DNA無影響，較多DNA存在時，亦有干擾作用。如在試劑中加入適量CuCl2・2H2O可減少DNA的干擾，甚至某些已糖在持續加熱后生成的羥甲基糖醛也能與地衣酚反應，產生顯色復合物。此外，利用RNA和DNA顯色復合物的最大光吸收不同，且在不同時間顯示最大色度加以區分。反應2min后，DNA在600nm呈現最大光吸收，而RNA則在反應15min后，在670nm下呈現最大光吸收。