鑒別試驗

  用0.4%氫氧化鈉溶液配制0.001%的試樣液，在紫外吸收光譜中的最大和最小吸收波長，應與由藥典級葉酸配制的相同參比液相同。A256/A365的比值為2.80～3.00。

含量分析

 標準液的制備精確稱取藥典級標準葉酸30mg(干基計)，溶于每100ml含2ml氫氧化銨和1g高氯酸鈉的水溶液中。按照測定步驟中所使用的注射量，使用相同的溶劑定量地調整體積，因而經色譜分析的是2～5μg的葉酸。

試樣液的制備 按標準溶液的方法制備，使用經精確稱重的試樣，并按標準溶液的方法調整至相同體積。

流動相在1000ml容量瓶中放人35.1g高氯酸鈉、1.40g磷酸二氫鉀、7.0 mL1mol/L氫氧化鉀和40ml甲醇，用水定容后，混勻。用1mol/L氫氧化鉀調節pH值至7.2(為符合分析系統的要求，甲醇濃度可改變，以適于葉酸的流出時間)。

色譜分析系統常用的是在室溫下操作的高壓液相色譜儀，裝有一(25～30)cm×4mm的不銹鋼柱，其中充填直徑為5～10μm的多孔硅或陶瓷微粒化學鍵合的十八烷基硅烷。流動相應保持一定的壓力和流速，以取得要求的分辨率(見下述系統適用性試驗)和適宜的流出時間。使用能在254nm處吸收紫外線的檢測器。

系統適用性溶液用每100ml中含2ml氫氧化銨和1g高氯酸鈉的水溶液作為溶劑，配制每ml各含1mg藥典級參比標準葉酸和藥典級甲酰四氫葉酸鈣的溶液。使用前通過一孔隙度≤1μm，的膜濾器過濾溶液。

系統適用性試驗用色譜儀分離相同體積(可達25μl)的標準液的5個進樣，并按檢測步驟測定峰響應值。按公式100×(標準偏差/平均峰響應值)計算峰響應值的相對標準偏差，不得超過2%。用相同方式注射25μ1體積的系統適用性溶液。按色譜儀通用試驗用于R的公式計算甲酰四氫葉酸鈣和葉酸之間的分辨率系數，不得小于3.6(用特殊的柱時，減少流動相中的甲醇量可提高分辨率)。

測定步驟用適當的進樣閥或高壓微型注射器，將相等體積(25#1以下)的試樣液和標準液導入色譜儀，測定兩溶液所得主峰的響應值。按下式計算試樣中的葉酸(C19 H19N7O6)含量(mg)。

葉酸含量/mg=Vc×(Pu/Ps)
式中V——試樣液體積，ml；
c——標準溶液中藥典級標準葉酸的濃度，mg/ml；
Pu和Ps——分別為試樣液和標準液的主峰響應值。