芹菜素誘導人卵巢癌細胞凋亡作用及機制研究

     卵巢癌目前仍是婦科腫瘤中病死率最高的疾病。盡管采用了腫瘤細胞減滅術與多種化療方案，但是其5 a存活率依然無明顯改善。因此，探討新的治療卵巢癌的藥物是目前的研究課題。芹菜素(Api)是一種分布廣泛的黃酮類化合物，大量存在于水果、蔬菜、豆類及茶葉中，在芹菜中含量最高。

研究表明芹菜素在體外能夠顯著抑制多種腫瘤細胞的增殖，其作用機制主要包括以下幾個方面：① 誘導細胞凋亡。芹菜素通過提高細胞內活性氧水平，降低線粒體跨膜電位促使細胞色素c(Cyt c)釋放并激活capase一9的作用，進而導致細胞內caspase一3蛋白酶活化，引起細胞凋亡 。② 細胞周期阻滯。 芹菜素通過下凋細胞周期蛋白Bl(cyclin B1)的表達及降低cyclin B1結合的周期蛋白依賴激酶CDK1活性將結腸癌、乳腺癌、黑色素瘤細胞阻滯在G，/M 期 。③ 促進癌細胞分化。

芹菜素可促進HL260細胞向單核細胞分化。細胞凋亡的調控根據其起始信號的細胞部位不同，主要有2條誘導途徑：死亡受體途徑和線粒體途徑，不同的死亡信號通過不同的途徑誘導細胞凋亡。最近的研究表明線粒體是細胞內死亡信號的重要感受器與放大器，在細胞凋亡早期，核染色體DNA還未改變之前，已出現結構和功能的變化，說明線粒體在細胞凋亡調控過程中起重要作用 。有研究表明芹菜素經線粒體途徑誘導人胃癌細胞BGC823細胞凋亡 。本研究旨在驗證芹菜素是否通過活化線粒體信號轉導通路誘導人卵巢癌細胞SKOV3凋亡，以期為卵巢癌的治療尋找新的藥物提供理論基礎。

1 實驗資料

1.1 主要試劑芹菜素genin購自Sigma公司，RPMI一1640培養液購自Gibco公司，新生牛血清購自杭州四季青生物工程公司，羅丹明123，caspase一9分光光度法檢測試劑盒購自南京凱基生物公司，caspase一9抑制劑(Ac—LEHD—CHO)購自 Alexis公司，bcl一2、bax、Cyt c、caspase一9，caspase一3和B— actin抗體購自Santa Cruz公司，辣根過氧化物酶標記的羊抗兔、羊抗鼠二抗均購自武漢博士德公司。

1.2 細胞培養 人卵巢癌細胞株SKOV3由河北醫科大學第四醫院科研中心惠贈。用含有10%小牛血清、100 IU/mL青霉素和100 mg/L鏈霉素的RPMI一1640培養液，在37℃ ，5%CO 的飽和濕度的培養箱內培養傳代。

1.3 PI染色流式細胞術測定細胞凋亡率 收集PBS、芹菜素 (20，40，80 o.mol/L)作用48 h后的細胞2.0×10 個，用4℃ 預冷體積分數為0.75的乙醇固定細胞，加入碘化丙啶(PI)均勻染色，30 min后用流式細胞儀檢測凋亡率。

1.4 細胞線粒體跨膜電位(△II，m)檢測 收集PBS、芹菜素(2O，40，80 i~mol/L)和芹菜素 40 I.Lmol/L加Ac—LEHD—CHO作用 48 h后細胞2.0×1O 個，用PBS洗滌細胞2次，重懸于羅丹明123染色液(終濃度5 p,mol/L)中，于37℃ 避光孵育30 min，再用PBS洗滌細胞2次，利用流式細胞儀以羅丹明123 為熒光指示劑檢測細胞線粒體A+m 的改變。羅丹明123的激發波長為475 nm，發射波長為525 nnl。

1.5 caspase一9活性測定取未處理和經藥物處理48 h的細胞3×10 ～5×10。個，按caspase一9分光光度法檢測試劑盒說明書進行操作，即用50 L冰冷Lysis Buffer懸浮細胞，置冰上2O min；4℃ 離心(10 000 r/min)3 min，把離心上清轉移至新的管中，置冰上；用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度；吸取50 L含5O一200 g蛋白的細胞裂解上清；如體積不足 5O L用Lysis Buffer補足至總體積5O L；加入50 L的2× Reaction Buffer(使用前每5O L 2×Reaction Buffer加入0.5 p,L DTT)；加入5 L caspase一9底物并于37 oC避光孵育4 h；用酶標儀在 ：405 nm測定其吸光值。通過計算OD誘導劑/OD陰性對照的倍數來確定凋亡誘導劑組caspase一9的活化程度。以Lysis Buffer和Reaction Buffer混合物作為參比。

1.6 Western印跡分析收集1×10 個以上細胞，2 500 r/ min離心10 min，冰PBS洗2次，加入100 L細胞裂解液(10 mmol/L Tris—C1，pH 8.0，1 mmol/L EDTA，20%SDS，5 retool/ L DTT和10 mmol/L PMSF)于冰上裂解1 h，12 000 r/min離心 5 min，收集上清。Lowry法測定蛋白含量。加入20 L的5×上樣緩沖液(250 mmol/L Tris～HC1 pH 6.8，10%SDS，50%甘油， 0.5%溴酚藍，5%二巰基乙醇)，加熱變性。用10%SDS一聚丙烯酰胺凝膠(檢測Cyt時用15%)電泳分離蛋白質。凝膠上的蛋白帶轉移到PVDF膜上，封閉液封閉膜上的蛋白結合位點2 h。加入一抗(bcl一2、bax、caspase一9、caspase一3、Cyt C， 1：200；B—actin，1：400)，4℃孵育過夜；加相應辣根過氧化物酶標記的二抗(1：2 000)，37℃孵育1 h。ECL檢測，掃描。

收集細胞(1×10“L )，于冰浴預冷的勻漿緩沖液(250 mmol/L Sucrose，20 mmol/L Hepes KOH ，pH 7.5，10 mmol/L KC1，1.5 mmol/L MgC1，，1 mmol/L EDTA，1 mmol/L DTT，0.1 mmol/L PMSF)400 L重懸，移人玻璃勻漿器內于冰浴中勻漿 5 min，勻漿液于4℃ ，3 O00r/min離心10 min，共2次，取上清于4 oC，12 000 r/min離心15 min，收集的上清即為不含細胞核和線粒體的胞漿成分。測定蛋白含量后進行Wester印跡分析。

1.7 統計學處理 實驗均重復3次。所有數據用i±s表示，采用SPSS 10.0統計軟件對數據進行單因素方差分析 (one—way ANOVA)，P<0.05為有顯著性差異。

2 結 果

2.1 芹菜素對SKOV3細胞凋亡的影響PI染色FCM分析結果顯示，芹菜素(20，4O，80 p,mol/L)處理SKOV3細胞48 h后的凋亡率分別為13.1%，20.6%和34.O%，較對照組2.9%高。說明芹菜素具有促進SKOV3細胞凋亡作用，呈濃度依賴性。不同濃度的芹菜素處理SKOV3細胞48 h，PI染色FCM 檢測細胞凋亡。見圖1。

2.2 芹菜素對SKOV3細胞線粒體跨膜電位的影響 用羅丹明 123作為熒光探針測定線粒體跨膜電位，其被線粒體攝取的量與A,m成正比。芹菜素(20，4O，8O~mol/L)處理后，SKOV3 細胞的羅丹明123的熒光強度分別為105.0±3.3，98.4±3.3和65.7±5.0，較對照組138.0±3.5明顯降低。不同濃度的 芹菜素處理SKOV3細胞48 h，用羅丹明123不熒光探針測定線粒體跨膜電位，見圖2。且隨著芹菜素濃度增加熒光強度降低。表明芹菜素降低SKOV3細胞線粒體跨膜電位與劑量呈正相關。

2.3 芹菜素對SKOV3細胞caspase一9活性的影響oaspase一9 是線粒體誘導凋亡途徑中的關鍵caspase，芹菜素(20，40，80 txmol/ L)作用于SKOV3細胞48 h后，分光光度法檢測caspase一9活性，結果發現caspase一9活性分別為對照組的5.0，7.0和8.5 倍，而芹菜素 40 ixmoL/L合用caspase一9抑制劑組的caspase一9 活性僅比對照組增加1.4倍，不同濃度的芹菜素處理SKOV3細胞48 h后檢測caspase一9活性(i± ，n=3)，見圖3。可見 AP1以劑量依賴方式增加easpase一9活性，caspase一9抑制劑能顯著抑制芹菜素增強caspase一9活性作用。說明芹菜素誘導 SKOV3細胞凋亡與活化線粒體途徑相關。

2.4 芹菜素對凋亡線粒體途徑相關蛋白表達的影響 為進一步證實芹菜素通過活化線粒體途徑誘導SKOV3凋亡，本研究進一步檢測凋亡線粒體途徑相關蛋白的表達。隨著芹菜素濃度增大，bax蛋白表達增加，bcl一2蛋白表達降低，bax/bcl一2比值逐漸增大，Cyt C釋放隨芹菜素濃度升高而增加，easpase一9和 easpase一3蛋白表達也隨芹菜素濃度升高而增加。easpase一9 抑制劑Ac—LEHD—CHO能阻斷芹菜素的上述作用。不同濃度 芹菜素處理SKOV3細胞48 h，Western印跡分別檢測，見圖4。

3 討 論

芹菜素可以使人前列腺癌細胞及人白血病細胞HL一60發生選擇性周期阻滯，并誘導細胞凋亡。其誘導凋亡的機制可能是通過細胞色素c的釋放及半胱氨酸酶(casepase一9，casepase一3)的激活而實現 。此外，芹菜素也可以通過激活 p53/waft途徑發揮抗腫瘤作用。芹菜素能使腫瘤細胞內p53蛋白、p21/WAFI蛋白水平升高，二者可以使細胞周期發生阻滯，并通過p53途徑誘導腫瘤細胞凋亡。核因子一KB(NF— KB)、B細胞淋巴瘤/白血病2(bcl一2)，bax(bcl一2的家族成員)也參與了芹菜素的誘導腫瘤細胞凋亡作用 。NF—KB 的活化能阻止處于半胱氨酸酶聯反應上游的casepase一8活化，并引起凋亡抑制劑蛋白的表達。芹菜素能夠抑制NF～nB 蛋白的表達，使bax和bcl一2的比值發生轉變，最終誘導細胞凋亡的發生。筆者采用PI染色FCM分析發現：隨著芹菜素濃度升高，SKOV3細胞凋亡率增加。說明芹菜素具有促進SK— OV3細胞凋亡作用。

線粒體跨膜電位在維持線粒體膜的完整性和功能方面起著重要作用。本研究用一種能被線粒體選擇性吸收的熒光染料羅丹明123作為指示劑，它的吸收率與△ m成正比，FCM 分析測定結果顯示，芹菜素能降低SKOV3細胞中羅丹明123的熒光強度，呈劑量依賴性。表明芹菜素能以劑量依賴方式降低 SKOV3細胞中△ m。線粒體依賴性細胞凋亡通路中，線粒體跨膜電位降低導致Cyt C釋放增加。筆者用Western印跡檢測SKOV3細胞胞漿中細胞色素C蛋白的表達，結果證實隨著 芹菜素濃度增大，細胞色素C表達增加。以上結果表明，芹菜素能降低SKOV3細胞線粒體跨膜電位，促進細胞色素C釋放。

Cyt C從線粒體釋放后與ATP、凋亡蛋白酶激活因子 (Apaf一1)聯合作用，依次激活caspase一9，caspase一3和 PARP等，導致細胞凋亡。本實驗用caspase一9分光光度法檢測試劑盒檢測caspase一9的活性，發現芹菜素能增加SKOV3 細胞中easpase一9的活性。用Western印跡檢測發現芹菜素能上調caspase一9和caspase一3蛋白的表達。Bcl一2家族成員在細胞凋亡的線粒體途徑中起重要調控作用 。在細胞凋亡過程中，bcl一2家族促凋亡成員如bax過表達，形成同源二聚體后被激活，發生構象改變，可引起線粒體大量釋放Cyt e；而抗凋亡成員如bcl一2和bcl—XL過表達，與bax形成異源二聚體，可對Apaf一1結構進行調控，抑制Cyt C釋放，最終發揮抑制細胞凋亡作用 。筆者用Western印跡檢測SKOV3 細胞中bax和bcl一2蛋白的表達情況，發現芹菜素以劑量依賴方式上調bax的表達，下調bcl一2的表達，使bax/bcl一2的比值增大。而caspase一9 抑制劑Ac—LEHD—CHO能阻斷芹菜素的上述作用。說明芹菜素 通過調節bax/bcl一2比值激活SKOV3細胞中caspase一9及 caspase一3級聯反應。

綜上所述，芹菜素能上調bcl一2家族促凋亡成員bax蛋白表達，下凋bel一2蛋白表達，使bax/bcl一2比值升高，降低線粒體跨膜電位，促進Cyt c釋放，從而激活caspase～9及 caspase一3級聯反應，通過調控線粒體凋亡誘導途徑誘導人卵巢癌SKOV3細胞凋亡。