酯蟾毒配基
背景及概況】[1][2][3]
蟾酥是常用的天然中藥組，提取于蟾蜍科動物中華大蟾蜍（Bufo bufo gargarizans Cantor）或黑眶蟾蜍（Bufo melanostictus Schneider）的干燥分泌物，具有多種生物活性，包括鎮痛、消炎、麻醉，還有抗癌、抗輻射、強心等，因此在中醫學臨床治療中具有重要的價值。由于近年來大量的實驗研究證明，蟾酥在臨床治療惡性腫瘤呈現出強大的藥理活性，從而引起學界的廣泛關注。目前人們圍繞著蟾酥的抗癌活性，已分離出多種活性成分，可以通過上調P53 蛋白的表達并提高Bax/Bcl-2 表達比值，誘導骨肉瘤細胞發生凋亡。蟾酥中的主要成分有蟾蜍甾二烯類、強心甾烯蟾毒類、吲哚堿類、醇類及多糖、氨基酸、肽類以及腎上腺素等，其有效成分多為脂溶性成分，其中蟾毒靈（bufalin，BL）、華蟾酥毒基（cinobufagin，CBG）、酯蟾毒配基（resibufogenin，RBG）等占較大比例（約 10%），它們對心血管系統、腫瘤細胞均有顯著的藥理活性。華蟾素注射液中主要含有酯蟾毒配基，蟾蜍色胺，核苷和多肽四大類活性成分。其中含量僅占百萬分之一的酯蟾毒配基類成分已被越來越多的研究證實是該藥發揮抗腫瘤作用的有效物質，包括酯蟾毒配基、華蟾酥毒基、蟾毒靈等蟾蜍甾烯類化合物。
酯蟾毒配基作為蟾酥的有效成分之一，推測天然中藥單體分子酯蟾毒配基可以通過誘導骨肉瘤細胞發生凋亡，從而抑制其腫瘤細胞的增殖能力。采用MTT實驗檢測不同濃度酯蟾毒配基處理后的骨肉瘤細胞增殖情況，MTT檢測結果顯示，酯蟾毒配基在體外水平可以有效抑制骨肉瘤細胞的增殖能力，其對腫瘤增殖能力的影響呈劑量依賴性相關。此外，Western Blotting結果顯示酯蟾毒配基可以上調骨肉瘤細胞P53蛋白表達量，該結果提示酯蟾毒配基可能通過觸發骨肉瘤細胞發生凋亡，從而抑制腫瘤細胞的生長。
【藥代動力學】[2]
分別于大鼠尾 iv 給予蟾酥提取物 0.8 mg/kg 后 2、5、10、15、20、30、45、60、90 min，眼眶取血，采用乙腈沉淀蛋白與液液萃取相結合方法進行血漿樣品預處理，以 HPLC 法測定大鼠血漿中蟾毒靈、華蟾酥毒基及酯蟾毒配基的質量濃度，以 Kinetica 軟件擬合藥動學參數。結果顯示蟾毒靈、華蟾酥毒基及酯蟾毒配基均得到很好的分離，重現性、精密度、線性關系良好，達到體內分析要求；經非房室模型擬合，得到蟾毒靈、華蟾酥毒基及酯蟾毒配基在大鼠體內主要藥動學參數；iv 給藥 30 min 時，血藥濃度均降至 Cmax的 1/5 以下。蟾蜍甾烯類成分在大鼠體內代謝較為迅速，具體如下：
【分離純化】[4]
1. 上樣硅膠的制備：取干蟾皮粗粉（過 2 號篩）250g，加入 10 倍量 80% 的乙醇回流提取 2 次，每次 2 h，回收乙醇至無醇味，濃縮至生藥濃度 1 g/mL，加入適量 200～300 目硅膠，蒸干，研磨均勻，60℃ 干燥 1 h。即得上樣硅膠。
2. 干蟾皮中酯蟾毒配基RBG、華蟾酥毒基CBG含量測定
1）色譜條件選擇：超高效高壓液相色譜儀-紫外檢測器；色譜柱為BEH phenyl1.7μm，2.1 mm×100 mm column；柱溫35℃；流動相為乙腈-水（30∶70）；流速為0.3 m L / min；檢測波長為 296 nm。
2）對照溶液的制備：分別精密稱取 RBG 對照品 6.06mg、CBG 對照品 6.30 mg，分別加甲醇溶解并定容至 10 mL棕色量瓶。制成 0.606、0.630 mg/mL 的對照品貯備液，再從上述對照品貯備液中分別精密吸取 0.9 mL和1mL，加甲醇定容至100 mL 棕色量瓶中，搖勻，得混合對照品溶液( RBG5.454μg/mL、CBG6.300μg/mL) 。
3）供試品溶液的制備： 取直徑為 20 mm×300 mm 的層析柱，稱取適量 200～300 目硅膠，濕法裝柱。稱取上樣硅膠，干法上樣，以環己烷-氯仿-丙酮( 4∶3∶3) 混合溶液洗脫，收集洗脫溶液，蒸干，甲醇定容，0.22μm 微孔濾膜濾過，棄初濾液，取續濾液，分別測定 RBG，CBG 含量。
4）標準曲線的制備： 取 RBG、CBG 混合對照品溶液，分別進樣 0.5、1、2、3、4、5 μL，并測定 3 次。以 RBG、CBG的進樣量(μg) 為橫坐標，以峰面積為縱坐標繪制標準曲線。得 RBG 回歸方程為 y = 2856 882.8877x + 70.504 1，R2= 1.0，CBG 回歸方程為 y = 2927858.5200 + 96.213 7，R2= 1.0。結果表明，RBG 在 2.7～27.3μg 范圍內線性關系良好，CBG 在 3.2～31.5μg 范圍內線性關系良好。
純化條件徑高比為 2∶14，上樣量為10g，洗脫溶劑用量為160mL。在 9.32-300μg / mL 濃度范圍內。采用該純化工藝所得 RBG、CBG 總含量為 5.42% ，RSD為2.65%。總轉移率為73.09%，RSD 為0.18%，該純化工藝穩定，方法可行。
【應用】[1]
酯蟾毒配基的主要藥理作用為抗腫瘤。運用現代色譜技術分離華蟾素注射液，得到酯蟾毒配基類成分，采用 HPLC-DAD-FT-ICR-MS 分析并鑒定酯蟾毒配基類化合物的主要單體。通過體外細胞篩選酯蟾毒配基抗腫瘤的活性，在體內建立胰腺癌荷瘤裸鼠模型以評價酯蟾毒配基藥效，在體外將分離所得酯蟾毒配基的主要活性單體進行抗胰腺癌活性篩選。結果顯示華蟾素注射液中的酯蟾毒配基在體外對肝癌 BEL7402 細胞，胃癌 BGC823 細胞和胰腺癌 SW1990，MIA Pa Ca-2 細胞的半數抑制濃度分別為0.47 ± 0.03，0.06 ± 0.01，0.06 ± 0.02，0.11 ±0.03g/L，酯蟾毒配基的半數致死量為 20 mg/kg，體內對 SW1990 荷瘤裸鼠的治療效果接近化療藥物吉西他濱，從酯蟾毒配基中分離并鑒定的 12個活性物質體外抗胰腺癌的活性篩選出日蟾毒它靈、沙蟾毒精和嚏根草苷元對 SW1990 和 BxPC-3 細胞具有明顯抑制作用。因此酯蟾毒配基在體外對胰腺癌細胞的抑制率與胃癌幾乎相同，在體內對胰腺癌荷瘤裸鼠有明顯治療效果，同時酯蟾毒配基中的單體成分日蟾毒它靈、沙蟾毒精和嚏根草苷元在體外對胰腺癌細胞有明顯的抑制作用。
【參考文獻】
[1] 高波, 魏曉露, 韓玲玉, 等. 華蟾素注射液中酯蟾毒配基的分離及體內外抗腫瘤活性篩選[J]. 中國實驗方劑學雜志, 2017 (16): 78-84.
[2]劉冬 [1, 杜守穎, 何秀峰, 等. 蟾毒靈, 華蟾酥毒基及酯蟾毒配基大鼠體內藥動學研究[D]. , 2012.
[3] 于海濤. 酯蟾毒配基抑制骨肉瘤臨床前實驗研究[D]. 長春中醫藥大學, 2014.
[4] 唐曉霞, 賈燕麗, 田港, 等. 干蟾皮中酯蟾毒配基和華蟾酥毒基的純化及其體外抗結腸癌活性的研究[J]. 中華中醫藥學刊, 2015, 33(9): 2243-2245.