氯化硝基四氮唑藍還原實驗及注意事項

         氯化硝基四氮唑藍(NBT)是脫氫酶和其它過氧化酶的底物，以及凝血因子I的沉淀試劑。NBT也是堿性磷酸酶底物之一，在堿性磷酸酶的催化下可生成不溶性的藍色產物。除此之外，NBT也常用于免疫組化（IHC）、免疫細胞化學（ICC）和蛋白印跡（WB）等實驗。NBT還原實驗是一種常用的用于檢查機體細胞免疫功能的方法，本文將對其實驗方法和注意事項進行總結。
 
         NBT是水溶性淡黃色活性染料，當其被嗜中性粒細胞的酶還原，可接受氫離子變為非水溶性的藍黑色甲臜顆粒，呈點狀或片狀沉淀在中性粒細胞胞漿內有酶活性的部位，因此可在顯微鏡下觀察并計數陽性細胞百分率。當機體受細菌、真菌和寄生蟲感染時，嗜中性粒細胞的吞噬能力明顯增強，還原NBT的能力亦隨之增高，而病毒性感染或非感染性疾病則不增高。
 
具體實驗方法如下：
 
         在載玻片上滴加20~30μL肝素溶液；取受試者手指血約40~60μL，與載玻片上的肝素混勻；加入NBT溶液一滴，輕輕吹吸混勻；置于濕盒中，放入37°C恒溫箱孵育15min后，轉至室溫再放置15min，并輕輕搖勻；將載玻片上的待檢樣本制成血涂片，自然晾干。
 
         瑞氏-吉姆薩染液染色：將載片平放在玻璃板上，將染料滴加到載玻片上，讓其均勻覆蓋住載片上的血細胞，染色時間約為2~3min。等瑞氏染液有變紅的趨勢時，迅速滴加等量的PBS溶液，繼續染色2~3分鐘。染色時間到后，用PBS溶液沖片。沖片結束后將載片放到陰涼處風干。在玻璃板上放好牙簽，將風干的載片倒扣在一根牙簽上，從背面滴加基姆薩染液進行扣染，染色時間約為10分鐘。時間到后用蒸餾水沖片，洗凈染液后常溫下風干。
 
         鏡檢：凡中性粒細胞胞漿中含有藍色甲臜顆粒者為NBT陽性細胞，計數100個中性粒細胞，計算NBT陽性中性粒細胞的百分率。正常人外周血中性粒細胞陽性率約為10%。百分率愈高，表明中性粒細胞的吞噬功能越強。陽性細胞百分率可作為區別細菌性與病毒性感染的指標之一，當機體受細菌感染時，NBT陽性細胞增多，受病毒感染時，NBT反應一般正常。
 
注意事項：
 
1、血液涂片應厚薄均勻，以免影響染色結果：太厚時紅細胞容易重疊并易皺，太薄時又不容易找到白細胞；
2、血溶液要干透后才能染色，否則染色時血膜容易脫落；
3、瑞氏-吉姆薩染液不能過少，以防染液蒸發引起染液沉淀；
4、如果染色過淡，可復染，但最好不復染；染色過深可用水沖洗或浸泡，還可用75%的乙醇脫色3~5s再鏡檢。如果染色過深或過淺，應調整染色時間或工作液的濃度；
5、染色液可重復使用，但不能多次重復，若有沉淀物應過濾后使用。
 
         NBT還原實驗可判斷機體是否有感染性疾病，以及感染是否為病毒感染。NBT實驗是診斷全身性感染的一種輔助方法，并作為判定嗜中性粒細胞殺菌功能的指標，以診斷吞噬功能缺陷癥。但是在實驗中要留心以上注意事項，方能得到準確的檢測結果。同時為了安全和健康，要做好防護措施，穿實驗服并戴一次性手套。